A espectrofotometria é um método utilizado para medir o quanto uma substância química absorve a luz, medindo a intensidade quando um feixe de luz passa através da solução da amostra.
O princípio básico é que cada composto absorve ou transmite luz em uma certa amplitude de comprimento de onda. Assim, a medida também pode ser usada para medir a quantidade de uma substância química conhecida.
A espectrofotometria é muito utilizada nas áreas de biologia, físico-química, indústria e em diversos laboratórios, incluindo de análises clínicas.
Conceitos da espectrofotometria
O conhecimento da absorção de luz pela matéria é a forma mais usual de determinar a concentração de compostos presentes em solução. Todo composto químico absorve, transmite ou reflete luz (radiação eletromagnética) em uma certa amplitude de comprimento de onda.
Por meio da espectrofotometria é realizada a medição da intensidade da luz em comprimentos de onda, sendo que os componentes de uma solução podem ser identificados por seus espectros característicos ao ultravioleta, visível ou infravermelho.
A técnica utiliza a propriedade das soluções de absorver ou transmitir a luz para quantificar reações. Na prática, a quantidade de luz absorvida ou transmitida é proporcional à concentração da substância em solução. Como uma impressão digital, saber exatamente a cor absorvida, nos permite identificar e quantificar materiais diferentes.
Quanto mais concentrada for a solução, maior será a absorção de luz. Por outro lado, a cor da solução é determinada pela cor da luz transmitida.
TRANSMITÂNCIA
Exprime a fração da energia luminosa que consegue atravessar uma determinada espessura de um material, sem ser absorvida. Ou seja, a capacidade de transmitir a luz.
ABSORBÂNCIA
Exprime a fração da energia luminosa que é absorvida por uma determinada espessura de um material. Ou seja, a capacidade de absorver a luz.
A absorbância de uma solução está relacionada com a transmitância. Quando a absorbância de uma solução aumenta, a transmitância diminui.
Transmitância e absorbância tendem a ser grandezas complementares. Assim, sua soma (para a mesma energia e comprimento de onda incidente) é aproximadamente igual a 1, ou 100%. Se 90% da luz é absorvida, então 10% é transmitida.
CORES EM ESPECTROFOTOMETRIA
A luz é uma forma de radiação eletromagnética que possui características de onda e de partícula (fóton). Os diferentes elementos absorvem energia em comprimentos de onda específicos.
A cor de uma solução está relacionada ao comprimento de onda complementar ao apresentado. Portanto, uma solução aparece como branca porque transmite luzes de todas as cores. Quando absorve luzes de todas as cores, a solução é preta. Finalmente, a solução é verde quando absorve luz vermelha e transmite luz verde (amarelo + azul), denominada de cor complementar.
As radiações eletromagnéticas com comprimento de onda entre 380 e 780 nm são visíveis ao olho humano. Abaixo de 380 nm é denominada ultravioleta (UV) e acima de 780 nm correspondem à zona infravermelha.
Relação entre comprimento de onda e as características de cor:
| Comprimento de onda | Cor absorvida | Cor complementar | ||
|---|---|---|---|---|
| abaixo de 380 nm | ultravioleta | |||
| 380 a 435 nm | violeta | verde-amarelado | ||
| 435 a 480 nm | azul | amarelo | ||
| 480 a 490 nm | azul-esverdeado | laranja | ||
| 490 a 500 nm | verde-azulado | vermelho | ||
| 500 a 560 nm | verde | púrpura | ||
| 560 a 580 nm | verde-amarelado | violeta | ||
| 580 a 595 nm | amarelo | azul | ||
| 595 a 650 nm | laranja | azul-esverdeado | ||
| 650 a 780 nm | vermelho | verde-azulado | ||
| acima de 780 nm | infravermelho | |||
PRINCÍPIO DO ESPECTROFOTÔMETRO
O espectrofotômetro é o equipamento utilizado para determinar os valores de transmitância (luz transmitida) e absorbância (luz absorvida) de uma solução em um ou mais comprimentos de onda.
Ele mede a quantidade de fótons (a intensidade da luz) absorvida depois de passar pela amostra. A quantidade de uma substância química conhecida (concentração) também pode ser determinada.
Componentes do espectrofotômetro
Alguns componentes são comuns a todos os espectrofotômetros. A luz, fornecida por uma lâmpada, é fracionada pelo prisma (monocromador) nos comprimentos de onda que a compõem (luzes monocromáticas).
O comprimento de onda selecionado é dirigido para a solução contida em uma cubeta. Parte da luz é absorvida e parte é transmitida. A redução da intensidade luminosa é medida pelo detector (célula fotelétrica) porque o sinal elétrico de saída do detector depende da intensidade da luz que incidiu sobre ele.
O sinal elétrico é lido como uma absorbância e é proporcional à concentração da substância absorvente existente na cubeta.
(a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difração, (d) fenda seletora (e) cubeta contendo solução, (f) detector, (g) leitor.
CUBETAS PARA ESPECTROFOTOMETRIA
A cubeta, também chamada de célula, é o recipiente que contém a amostra, utilizada para permitir a leitura óptica.
As cubetas de espectrofotômetro são fabricadas em uma variedade de materiais para suportar diferentes padrões de comprimento de onda e requisitos do caminho óptico. As cubetas podem ser de quartzo ou vidro (reutilizáveis) e ainda de acrílico (descartável), sendo empregadas dependendo de qual é a faixa o espectro a ser analisada.
A de quartzo é usada para a região ultravioleta do espectro, já o vidro é usado para a faixa visível e a cubeta de acrílico, para ensaios rápidos e menos exigentes.
É preciso ter cuidado ao manusear as cubetas, mesmo uma ligeira impressão digital pode interferir nos resultados. É muito importante não tocar na superfície óptica da cubeta, pois óleos de sua pele, partículas de tecidos de limpeza, poeira e outros contaminantes podem afetar as leituras. A utilização e limpeza corretas são a base de qualquer análise espectrofotométrica, ajudando a evitar erros de medição.
As cubetas não devem ser secas por aquecimento em uma estufa ou chama porque isso pode provocar danos físicos e/ou mudar o caminho óptico.
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PADRÃO BRANCO EM ESPECTROFOTOMETRIA
Quando um feixe de luz monocromática atravessa uma cubeta de espectrofotômetro, parte da luz sofre refração, reflexão, absorção pelos reagentes e outras interações indesejáveis.
Para eliminar tais interferências, deve-se zerar o aparelho com uma solução que é denominada “branco”. O branco deve conter todos os constituintes do sistema, exceto a amostra a ser estudada. A cada conjunto de determinações, bem como após alterar o comprimento de onda, o aparelho deve ser sempre zerado e calibrado com o tubo que contém o branco.
Referências:
COMPRI-NARDY, Mariane B., STELLA, Mércia Breda, OLIVEIRA, Carolina de. Práticas de Laboratório de Bioquímica e Biofísica. Guanabara Koogan.
ROSA, Gilber, GAUTO, Marcelo, GONÇALVES, Fábio. Química Analítica: Práticas de Laboratório – Série Tekne. Bookman, 2013.
DIAS, Silvio Pereira, VAGHETTI, Júlio Pacheco, LIMA, Éder Cláudio, BRASIL, Jorge Lima. Química Analítica: Teoria e Prática Essenciais. Bookman, 2016.
XAVIER, Ricardo M., DORA, José Miguel, BARROS, Elvino. Laboratório na Prática Clínica, 3ª edição . ArtMed, 2016.
Fundamentos da espectrofotometria. www.ufjf.br
